Microscopia
É preciso compreender que o entendimento da organização estrutural das células é indispensável para desvendar e estudar seu funcionamento. Portanto, os avanços na microscopia óptica, que foi a primeira a ser desenvolvida, e o aperfeiçoamento das técnicas de preparação das células e tecidos possibilitou compreender cada vez mais suas estruturas e dinâmica.
Abaixo você encontrará o Manual Prático de Microscopia, ele foi elaborado pelos monitores da Disciplina, e tem como objetivo indicar a correta manipulação e preservação dos microscópios mais usados na disciplina
Microscopia Óptica
Em um microscópio de fluorescência, ao contrário de microscópios ópticos convencionais, a luz passa por dois filtros (não apenas por um). O primeiro filtra a luz antes que ela atinja a amostra, selecionando o comprimento de onda que irá excitar o corante usado na amostra, e o segundo filtra a luz emitida pela amostra, eliminando outros comprimentos de onda e permitindo a visualização apenas do comprimento específico para o corante da amostra. Entre um filtro e outro encontra-se um espelho difusor de feixes (espelho dicroico), que direcionará a luz oriunda da fonte para a objetiva e a amostra e desta para a ocular.
O microscópio de fluorescência detecta essas moléculas fluorescentes, absorvendo a luz em um comprimento de onda e então a emitindo em outro, mais longo. Por exemplo, uma amostra é iluminada por um comprimento de onda entre 450 e 490 nm (azul), absorvendo-o, e é visualizado por um filtro que permite apenas a passagem de luz com o comprimento de onda emitido, entre 520 e 560 nm (verde), brilhando em um fundo escuro. Vários corantes podem ser usados ao mesmo tempo para destacar diferentes estruturas celulares.
Uma importante vantagem da microscopia óptica é que a luz é relativamente não destrutiva, não danifica a estrutura e, portanto, permite observar em células vivas o que de fato se encontra nas mesmas. Através da marcação dos componentes celulares particulares com sondas específicas e proteínas intrinsecamente fluorescentes, pode-se observar a dinâmica, as interações e o movimento presente em células vivas, detectando de forma mais fácil e prática proteínas e enzimas, moléculas específicas em tecidos, células ou estruturas celulares. Se utilizado um corante comum visto com microscopia convencional, dificilmente o objeto de estudo seria visualizado, ficando fracamente corado com a passagem de luz através dele (obviamente esses aspectos dependem diretamente do objetivo do estudo).
Outro tipo de técnica que se utiliza através da marcação fluorescente é o FISH, ou “Hibridização Fluorescente in Situ”, usado para destacar sequências de DNA ou RNA e cromossomos. Marca-se uma sequência alvo da amostra (que pode ser DNA ou RNA) com uma sonda ligada a um fluoróforo ou a um anticorpo; a sonda emitirá a luz fluorescente e esta será visualizada pelo microscópio de fluorescência. A técnica de FISH pode ser usada para identificar sequências de DNA durante a metáfase, detectar erros de rearranjo dos cromossomos ou então mapear genes específicos nos mesmos.
Enquanto nas microscopias anteriormente descritas era necessário cortar as amostras em finas fatias (sendo nitidamente observadas ao se focalizar um plano específico), na microscopia confocal é possível observar as amostras em suas três dimensões. Geralmente é utilizado com óptica de fluorescência; focalizam-se vários pontos da amostra, usando um laser para emitir luz através de um pequeno orifício, assim excitando a amostra, a qual emite a fluorescência. Esta é captada por um detector confocal com o orifício do laser (onde a luz que vem da amostra converge); assim obtemos imagens de uma plano focalizadas, enquanto as fora do plano são excluídas pelo detector. No final, obtemos várias “fatias” nítidas que depois podem ser unidas por computador, que tratará a imagem final (uma “pilha” de fatias tridimensional). Este tipo de microscopia é utilizado para observar a estrutura de polímeros, filamentos do citoesqueleto e cromossomos.
Microscopia Eletrônica
A microscopia eletrônica de transmissão (MET) permite observação da superfície de uma amostra em alta resolução. Assim como a MEV, a amostra recebe uma camada de platina, porém de forma obliqua, formando um maior depósito de platina em certas regiões (ficam mais espessas do que outras), causando um sombreamento que confere tridimensionalidade à imagem. A imagem pode ser visualizada em grande resolução (até 0,1nm), permitindo a observação de células e suas estruturas intracelulares, como organelas.
A microscopia eletrônica permite melhor visualização, já que seu poder de resolução permite a visualização de estruturas de até 0,1nm (200x melhor do que um microscópio óptico). Ela utiliza um feixe de elétrons para obter imagens de complexos moleculares dentro das células a uma resolução quase atômica e em três dimensões. É um meio bastante comum de visualização celular, porém mais caro e complexo que a microscopia óptica. O pesquisador utiliza técnicas de acordo com seu objetivo principal na visualização de seu material (uma célula ou um tecido, em cultura ou fixado em lâmina), dependendo dos aspectos a serem investigados – a amostra deve ser degrada, mas preservada pela fixação, para que possa ser observada.
A marcação, ao invés de fluoróforos, utiliza outros compostos, como ouro acoplado a um anticorpo, colocado antes de se fixar a amostra. Por ser eletrodensa, a partícula de ouro é visualizada como um ponto preto no microscópio. A imagem final, em escala de cinza, é colorida artificialmente por computador, quando necessário.
Na microscopia eletrônica de varredura (MEV), a amostra é fixada, desidratada e coberta por uma camada de metal pesado, e então é varrida por um feixe de elétrons. O feixe atinge a superfície da amostra, produzindo uma imagem tridimensional dela em computador, rica em detalhes, com baixa resolução (até 10nm), porém com grande profundidade de foco. Este tipo de microscopia é muito útil para visualizar células e tecidos intactos, assim como pequenos objetos.
A microscopia eletrônica de transmissão (MET) permite observação da superfície de uma amostra em alta resolução. Assim como a MEV, a amostra recebe uma camada de platina, porém de forma obliqua, formando um maior depósito de platina em certas regiões (ficam mais espessas do que outras), causando um sombreamento que confere tridimensionalidade à imagem. A imagem pode ser visualizada em grande resolução (até 0,1nm), permitindo a observação de células e suas estruturas intracelulares, como organelas.
